In seguito alle complesse vicende politiche connesse con l’occupazione francese della Toscana il Museo diventa un’isitituzione del Regno di Etruria. Fu voluto dal granduca di Toscana Pietro Leopoldo, mentre nel 1807 la Regina d’Etruria, Maria Luisa di Borbone, consacra il “Reale Museo” alla pubblica istruzione, con lo stabilirvi sei professori.

Sempre nel 1807 Domenico De Vecchi, uno dei professori che vi si stabilì, tenne il corso teorico pratico di astronomia, oltre a eseguire osservazioni astronomiche e meteorologiche. Infatti De Vecchi si dedicò alla “specola” di cui era dotato il museo dedicandosi all’osservazione delle posizioni delle stelle, comete, eclissi e occultazioni, con l’obiettivo di studiare il tempo e la longitudine.

Alla sua morte gli successe il francese Jean-Louis Pons, diventato celebre per la scoperta di comete a Marsiglia e, durante la sua permanenza a Firenze, continuò a scoprirne delle altre. Nel 1831, proprio il Granduca Leopoldo II chiamò l’ottico modenese G. B. Amici a dirigere la specola fiorentina. Questi, già noto nel campo dell’astronomia e della geodesia per i suoi obiettivi ed oculari, portò con se da Modena altri discepoli che contribuirono a far rinascere a Firenze la tradizioni dell’ottica e della meccanica di precisione.

A lui si deve anche la costruzione di due obbiettivi per telescopi tuttora esistenti presso l’Osservatorio. Nel 1859, gli successe il suo discepolo G. B. Donati. Donati riprese l’osservazione del cielo e propose la costruizione di un nuovo osservatorio su un luogo elevato nei dintorni di Firenze. La scelta cadde sul colle di Arcetri, vicino alla villa “Il Gioiello” dove Galileo trascorse gli ultimi anni della sua vita. Il 27 ottobre 1872 l’Osservatorio venne inaugurato e lo stesso Donati si impegnò per metterlo in funzione, ma nel 1873 purtroppo venne stroncato dal colera.

A lui successe il tedesco Ernst Wilhelm Tempel, disegnatore litografo e grande appassionato di astronomia: si dedicava alla scoperta e alla osservazione di comete, piccoli pianeti e nebulose, di cui fece una notevole quantità di disegni e di rilievi importanti, che gli valsero nel 1879 il premio reale dell’Accademia dei Lincei. La direzione dal 1895 al 1921 passò ad Antonio Abetti che con la nuova e completa montatura equatoriale fatta costruire per l’obbiettivo di Amici, effettuò numerose osservazioni di pianeti e di comete. Nel 1921 l’attività dell’Osservatorio cominciava a rivolgersi particolarmente alle ricerche di astrofisica, tanto che esso assumeva la denominazione ufficiale di “Osservatorio Astrofisico” ed è Giorgio Abetti, figlio di Antonio, a prenderne la direzione.

Nel 1924 l’Osservatorio fu potenziato con una torre solare, dedicata alla memoria di G.B. Donati, alta 25 metri dotata di uno spettrografo e di uno spettroeliografo e venne inoltre sostituito l’obiettivo dell’Amici con uno più potente, consentendo all’Osservatorio di effettuare le ricerche verso la fisica solare e di spettroscopia stellare. Nel 1925 Giorgio Abetti fu nominato titolare della cattedra di astrofisica nella Università di Firenze, mentre l’anno dopo, con un decreto, l’osservatorio entrò a far parte degli osservatori statali.