Dentro del Palacio de los Uffizi se encuentra el Teatro Medici, también de Buontalenti, que en la época de Florencia, la capital de Italia, era la sede del Senado. La forma del edificio es de herradura y descansa sobre una logia enteramente decorada con nichos en los que se encuentran estatuas de valientes florentinos que vivieron desde la Edad Media hasta el siglo XIX. Hoy el Palacio es el hogar de la Galería de los Uffizi, la galería de arte más importante del mundo. Fundamental para las escuelas artísticas toscanas a partir del siglo XIII, incluye obras de pintores venecianos, romanos, emilianos, flamencos, alemanes, españoles y franceses. Presenta obras maestras de Cimabue, Giotto, Gentile da Fabriano, Paolo Uccello, Piero della Francesca, Botticelli, Leonardo, Perugino, Giambellino, Correggio, Mantegna, Miguel Ángel, Rafael, Tiziano, Tintoretto, Caravaggio, Rembrandt, Goya y muchos otros.

No menos importantes son las estatuas clásicas y helenísticas que documentan el coleccionismo de los Medici. Además, las colecciones de tapices, mármoles antiguos y miniaturas. En la planta baja, en las salas de la antigua iglesia de S. Pietro Scheraggio, se encuentran valiosos frescos.

La Galería de los Uffizi fue también el primer museo accesible al público: desde 1591 era visible para cualquiera que lo solicitara al Gran Duque. Con sus cuatro siglos de historia, los Uffizi están considerados el museo más antiguo del mundo.

Los Medici enriquecieron continuamente la Galería con piezas heredadas de Vittoria della Rovere, esposa de Fernando II, con las compras del cardenal Leopoldo de’ Medici y con la colección de Autorretratos hoy expuesta en el Corredor Vasari, construido en 1565 por Vasari, que une los Uffizi con el Palacio Pitti.

Posteriormente, la Galería de los Uffizi recibió numerosas donaciones diplomáticas y herencias dinásticas que aumentaron el prestigio de la propia Galería y consagraron a Florencia como una de las capitales mundiales del arte.

A finales de 1998, la Donación Contini Bonacossi fue transferida a la Galería de los Uffizi, que incluye 35 pinturas, doce esculturas, muebles antiguos y mayólicas, que alguna vez fueron propiedad de Alessandro Contini Bonacossi. Esta colección es, sin duda, una de las adquisiciones más importantes de los últimos tiempos por parte de la Galería.

Renovado y reorganizado varias veces a lo largo de los siglos según los gustos culturales de las distintas épocas, el lugar de exposición incluye hoy 45 salas con aproximadamente 1.700 pinturas, 300 esculturas, 46 tapices, 14 muebles y cerámicas.

Las obras propiedad de los Uffizi ascienden en realidad a unas 4.800: el resto se divide entre depósitos y préstamos a otros museos.